複数の ParA/MinD ATPase が細菌細胞内の異なるカーゴの位置を調整します

Nature Communications volume 14、記事番号: 3255 (2023) この記事を引用

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

真核生物では、リニアモータータンパク質が細胞内の輸送と組織化を制御します。細菌では、空間制御に関与するリニアモーターが存在せず、ATPアーゼのParA/MinDファミリーが遺伝子ベースおよびタンパク質ベースの一連の細胞積荷を組織します。これらの積荷の位置は、いくつかの細菌種についてさまざまな程度で独立して研究されています。しかし、複数の ParA/MinD ATPase が同じ細胞内の多様なカーゴの位置をどのように調整できるかは依然として不明です。今回我々は、配列決定された細菌ゲノムの 3 分の 1 以上が複数の ParA/MinD ATPase をコードしていることを発見しました。我々は、7 つの ParA/MinD ATPase を持つ生物 (Halothiobacillus neapolitanus) を同定し、これらのうち 5 つがそれぞれ単一細胞積荷の空間制御に特化していることを実証し、各システムの潜在的な特異性決定因子を定義します。さらに、これらの位置決め反応がどのように相互に影響し得るかを示し、細菌細胞内で細胞小器官輸送、染色体分離、細胞分裂がどのように調整されているかを理解することの重要性を強調します。まとめると、我々のデータは、複数の ParA/MinD ATPase がどのように共存し、同じ細菌細胞内に基本的なカーゴの多様なセットを配置するために機能するかを示しています。

アクチンフィラメント、微小管、およびそれらに沿って歩くリニアモータータンパク質は、真核細胞の空間構成としてよく知られています。しかし、位置決めに関与するリニアモーターが存在しない細菌では、広範囲にわたる ParA/MinD (A/D) ATPase ファミリーが、プラスミド、染色体、および一連のタンパク質ベースの細胞小器官を空間的に組織しており、その多くは細胞の生存に不可欠です。そして病因。これまで最もよく研究されている 2 つの ATPase およびそのファミリーの同名遺伝子は、プラスミド分割と染色体分離に関与する ParA 1,2 と、ディビソームの位置決めに関与する MinD 3 です。あまり研究されていないのは、細菌微小区画（BMC）4、5、鞭毛6、7、走化性クラスター8、9、結合機構10など、多様なタンパク質ベースの細胞小器官の空間制御に関与する、原核生物全体に広く分布するA/D ATPアーゼのリストが増えていることである。

積荷は非常に多様であるにもかかわらず、A/D ATPase は多くの特徴を共有しています。(i) すべて ATP サンドイッチ二量体を形成し 11、(ii) 二量体化は位置決めマトリックス (ParA 様 ATPase のヌクレオイド 12、13) を結合するための界面を形成します。 MinD 様 ATPase の内膜 14、15、および (iii) 二量体化は、ATPase をそのカーゴに接続し、位置決めマトリックスからのその放出を刺激する同族パートナータンパク質の結合部位も形成します。たとえば、染色体分離では、ParA のパートナーは ParB であり、これは parS と呼ばれるセントロメア様の部位にロードされ、複製起点 (OriC) 近くの染色体上に大規模な複合体を形成します。この ParB-parS 複合体は、ParA ATPase 活性と核様体放出を局所的に刺激し、核様体上に ParA 勾配を生成します。 ParB-parS 複合体がヌクレオイドに結合した ParA 勾配を反対方向に追いかけると、姉妹染色体の分離が起こります 16。したがって、真核生物の染色体分離で使用される有糸分裂紡錘体装置とは異なり、原核生物は根本的に異なる空間構成モードを使用します。つまり、A/D ATPase が生物学的表面で波を作り、それぞれの積荷を配置します。

染色体の分離、細胞分裂の位置決め、および細胞小器官輸送反応は、いくつかの原核生物でさまざまな程度で独立して研究されてきました。しかし、複数の異なる積荷を配置するために単一の細菌内でどれだけの A/D ATPase をコードできるのか、あるいは細菌が同じ細胞内でそのような多様な基本積荷の配置をどのように時空間的に調整するのかは不明のままである。さらに、このような多様な細胞積荷の位置を決定する機構の変動と特異性の決定要因は依然として不明である。これは、A/D ベースの位置決め反応は通常、互いに独立して、A/D ATPase がほとんどないモデル細菌で研究されるためです。

今回我々は、配列決定された細菌の 3 分の 1 が複数の A/D ATPase をコードしていることを発見しました。これらの細菌の中で、7 つの推定 A/D ATPase を持つ Halothiobacillus neapolitanus (以下、H. neapolitanus) を同定しました。 H. neapolitanus の A/D ATPase 遺伝子の近傍分析により、いくつかの推定上の積荷が示唆されています。私たちは遺伝学と細胞生物学を使用して、H. neapolitanus の 5 つの A/D ATPase をカーゴに割り当てます。私たちの調査結果は、各 ATPase が特定の貨物タイプの位置決めと忠実な継承に直接特化していることを示しています。 A/D ATPase の扱いやすさと数により、H. neapolitanus は、細菌が染色体の分離と細胞分裂のプロセスを細胞小器官の輸送とどのように調整するのかを調べるための貴重なツールとなりました。この問題は、真核細胞ではよく研究されていますが、原核生物では未解決のままです。我々は、1 つの A/D ATPase の欠失が、DNA 複製、染色体分離、および/または細胞分裂の欠陥を介して、他の A/D ATPase によって配置された異種のカーゴの継承にどのように間接的な影響を与えるかを示します。また、鞭毛の位置が走化性クラスターの空間制御に影響を与えるという証拠も提供します。最後に、各 A/D ATPase を特定のカーゴに固有に結び付ける推定上の配列および構造決定基を特定し、最終的にこれらの関連する ATPase が同じ細胞内で共存して機能できるようにします。私たちの研究は共に、原核生物全体、および単一細胞内での多様な細胞積荷の空間制御に使用される最も広範囲に使用される ATPase ファミリーの機構の共通性と変異を調査します。

単一の生物内にいくつの ParA/MinD (A/D) ファミリー ATPase がコードされているかは不明です。この質問に答えるために、よく研究された A/D ATPase から生成されたコンセンサスタンパク質配列をクエリとして使用して、広範な tBLASTn 分析を実行しました (方法を参照)。すでに確立されているように 17 、NCBI 参照配列 (RefSeq) データベースの細菌の約 96% が少なくとも 1 つの A/D ATPase をコードしていることがわかりました (補足データ 1 および 2)。これらのヒットは細菌種ごとに分類され、A/D ヒットの数によって並べられました。この最初のリストから、10 ～ 20 個の A/D ATPase をコードする多くの細菌ゲノムが見つかりました。しかし、最も多くの A/D ATPase を持つこれらの細菌は、複数のプラスミドと染色体上にコードされたゲノムを持っており、それぞれが独自の ParA ベースの DNA 分離システムをコードしています 18。この研究では、複数の A/D ATPase がどのように共存し、同じセル内の異なるカーゴの位置を調整するかを理解することに特に焦点を当てました。したがって、データセットをさらにフィルタリングして、複数の A/D ATPase をコードしているが、染色体が 1 つだけで安定したプラスミドが存在しない細菌を特定しました (補足データ 1 および 2)。複数の遺伝要素にコードされたゲノムを持つ細菌を考慮した後でも、我々のバイオインフォマティクス分析により、配列決定された細菌の3分の1以上が複数のA/D ATPアーゼをコードしていることが明らかになりました（図1a、補足データ1および2）。

配列決定された細菌ゲノムの 96% は少なくとも 1 つの A/D ATPase をコードし、35% は複数の A/D ATPase をコードします。各スパイクは細菌種を表し、スパイクの長さは細菌ごとの固有の A/D ヒット数を示します。 b H. neapolitanus は、7 つの推定上の ParA/MinD 様測位システムをコードしています。遺伝子近傍分析により、各推定上の A/D ATPase に関連する推定上の積荷が関係付けられます。 c 実験的に検証されたParA / MinDファミリーメンバーに対するH. neapolitanus由来の各A / D ATPaseの多重配列アラインメントは、遺伝子近傍分析によって特定された推定上のカーゴをさらに示唆します。 H. neapolitanus の推定上の各 A/D ATPase は、他の細菌内で示された細胞積荷 (オレンジ色) を位置決めすることが示されているファミリーメンバーとクラスターを形成します。

次に、複数の A/D ATPase が同じセル内でどのように共存して、異なる貨物を配置できるかを決定することに着手しました。この疑問に対処するために、我々は複数の A/D ATPase をコードする細菌のリストから生物を特定しました (補足データ 1 および 2)。上位 1% の細菌 (6 つ以上の A/D ATPase をコードする) の中から、クロストリジウム属、バークホルデリア属、マイコバクテリア属、ビブリオ属、シュードモナス属、およびザントモナス属を含むいくつかの病原体を特定しました。また、非病原性で実験的に扱いやすい微生物である H. neapolitanus も同定しました。これは、1 つの染色体上に 7 つの推定 A/D ATPase をコードする、ゆっくりと成長する硫黄酸化化学独立栄養生物です (図 1b)。 A/D ATPase による空間制御は、急速に成長するモデル細菌で主に研究されています。 DNA 分離と細胞分裂が頻繁に起こらないため、より大きな観察窓が得られ、細胞小器官輸送の動態をより直接的に観察できるため、ゆっくりと増殖する細菌 (倍加時間 6 時間) を意図的に選択しました。 H. neapolitanus は、扱いやすさ、増殖速度の遅さ、および A/D ATPase の豊富さにより、さらなる研究に理想的な選択肢となりました。

H. neapolitanusのA / D ATPaseヒットが実際に空間制御因子であるかどうかを判断するために、遺伝子近傍分析（GNA）を実行して推定上のカーゴを特定しました（図1b）。 A/D ATPase 遺伝子はカーゴ関連遺伝子座の近くでコードされていることが多いため、GNA を使用すると機能を推測できます。たとえば、ParABS 染色体分離システムは通常、OriC19 付近でコード化されます。驚くべきことに、このアプローチを使用して特定した推定上のカーゴには、染色体および A/D ATPase ファミリーのすべての既知のタンパク質ベースのカーゴが含まれています 20,21。これらの多様な積荷の空間制御は多くの異なるモデル細菌で個別に研究されているが、複数の A/D ATPase によるそれらの協調的な位置決めが 1 つの生物内で一緒に研究されたことは一度もなかった。

各 A/D ATPase を特定のカーゴに結び付けるバイオインフォマティクス証拠の 2 つ目のラインとして、FlaG (Flanking Genes) 分析を使用して A/D ATPase 遺伝子近傍の保存性を調査しました 22。 FlaGs 分析は、入力として NCBI タンパク質アクセッションのリストを取得することによって機能的関連を予測し、近隣にコード化されたタンパク質を相同なグループにクラスター化します。 H. neapolitanusの各A / D ATPaseのホモログはBLASTpを使用して同定され、トップヒットはFlaGs分析の入力として使用されました（補足図1）。この分析により、複数の細菌門にわたって A/D ATPase 遺伝子近傍が強く保存されていることが示され、推定上の積荷がさらに示唆されています。結合 10 または窒素代謝に関連する A/D ATPase に関するデータが限られているため、この研究ではこれらのヒットをさらなる調査から除外しました。

残りの5つのA/D ATPアーゼを使用して、細胞カーゴを位置決めするために以前に確立されているParA/MinDファミリーメンバーに対して多重配列アラインメントを実行しました（図1c）。 H. neapolitanus の各 A/D ATPase は、他の細菌の特定の細胞積荷を配置することが知られている特定のファミリーメンバー (染色体 (ParA2)、ジビソーム (MinD23)、カルボキシソーム (McdA4,5)、鞭毛 (FlhG6)) でクラスター化されています。 ,7) および走化性クラスター (ParC8,9)。これらのデータは、GNA によって特定された推定貨物をさらに示唆する 3 番目の証拠を提供します。次に、我々は、バイオインフォマティクスに関係するカーゴの位置決めにおける各 A/D ATPase の役割を直接特定しようとしました。

細胞分裂前の染色体の分離は、細胞の生存にとって重要です。ほとんどの細菌では、忠実な染色体の分離と継承は、OriC19 の近くにコードされている ParAB システムによって媒介されます。 ParAB がないと、DNA は非対称的に遺伝し、その結果、無核細胞や倍数体細胞が生じ、細胞の適合性や細胞死が減少します 2。 H. neapolitanus では、OriC 付近にコード化された推定上の parAB システムが存在します (図 2a)。染色体分離を画像化するために、推定上の parA 遺伝子 (Hn2335) の下流にコードされる ParB ホモログを、蛍光タンパク質単量体ネオングリーン (mNG) に融合しました。 ParB-mNG は、細胞あたり 1 つまたは 2 つの点として観察されました (図 2b)。集団分析により、短い細胞は細胞中央に単一の焦点を持っているのに対し、長い細胞は細胞の4分の1の位置に2つの焦点を持っていることが示されました（図2b）。推定上のparA遺伝子（Hn2335）が欠失すると、ParB-mNG病巣は25％の細胞で完全に消失しました（補足図2d）。 ParB 焦点が存在する場合、それらは細胞の長さに関係なくランダムに配置され（図2c）、WT（野生型）細胞と比較して著しく明るくなりました（補足図2e）。外因性遺伝子座での Hn2335 による補完により、焦点の位置が回復しました（補足図 2h）。これらのデータは、ΔHn2335 で複製された染色体がもはや忠実に分離されず、その結果、無核細胞と倍数体細胞が生じたことを示唆しています。

a-d Hn2335 は染色体の分離に必要です。 Hn2335 は OriC の近くで見つかり、下流に ParB ホモログがコード化されています。 b、c 染色体の起点領域は、ParB ホモログを標識することによってタグ付けされました。薄赤色: 1 フォーカス/セル。暗赤色: 2 焦点/セル。短い WT 細胞は細胞中央に 1 つの焦点を持っていましたが、長い細胞は 4 分の 1 の位置に 2 つの焦点を持っていました。 ΔHn2335 細胞は、細胞の長さに関係なく、ParB 病巣のランダムな位置を示しました。 d 漫画の図は、WT細胞とΔHn2335細胞における染色体分離を示しています。 e-h Hn1364 はディバイソームの位置決めに必要です。 e Hn1364 は minE の上流にあります。 f、g ディビソームの位置は、狭窄部位の位置によって決定されました。密度グラフ上の各ドットは、特定された 1 つの狭窄部位を表します。 WT 細胞では、収縮部位は細胞の中央にありました。 ΔHn1364 では、細胞長全体にわたって収縮部位が見つかりました。 h 漫画の図は、WT 細胞と ΔHn1364 細胞の細胞分裂を示しています。 i–l カルボキシソームの位置は McdA によって決定されます。 i Hn0912 (mcdA) は、カルボキシソームシェルタンパク質と Rubisco をコードする遺伝子の近くで見つかります。 j、k カルボキシソームは、ルビスコ酵素の小サブユニット cbbS を標識することによって視覚化されました。密度グラフ上の各ドットは、1 つのカルボキシソーム焦点を表します。 WT 細胞では、カルボキシソームは細胞の長さに沿って分布しています。 ΔmcdA では、カルボキシソームは一方または両方の極に大きな極性焦点を形成しました。 l 漫画の図は、WT細胞およびΔHn0912細胞におけるカルボキシソームの分布を示しています。 m-p Hn0716 は鞭毛の位置とコピー数を制御するために必要です。 m Hn0716 は鞭毛関連遺伝子の近くに見つかります。 n、o 鞭毛の局在は、鞭毛基底体の成分 fliN を標識することによって可視化されました。密度グラフ上の各ドットは 1 つの FliN フォーカスを表します。 WT 細胞は単一極性 FliN 焦点を持っていました。 ΔHn0716 細胞では、FliN 病巣は細胞長に沿ってよりランダムに配置されました。 p漫画の図は、WTおよびΔHn0716細胞の鞭毛の局在化と数を示しています。q – t Hn0722は走化性クラスターの位置決めに必要です。 q Hn0722 は走化性関連遺伝子の近くで見つかります。 r、s 走化性クラスターは、応答制御因子 cheY を標識することによって視覚化されました。密度グラフ上の各ドットは、1 つの CheY 焦点を表します。 WT 細胞は単一の CheY 極焦点を持っていました。 ΔHn0722 変異細胞には通常、CheY 病巣がありません。 t 漫画の図は、WT 細胞と ΔHn0722 細胞の走化性クラスターを示しています。 (すべての画像) 示されている顕微鏡写真は、少なくとも 3 回の実験からの代表的な画像です。スケールバー: 2 μm。 (すべてのグラフ) MicrobeJ を使用して細胞を分析および定量化しました。 Y 軸では、セルの長さを増やすことによってセルが並べ替えられ、短いセルが上部に、長いセルが下部に表示されます。 X 軸は、中央セルからの距離をミクロン単位で表します。中央の垂直線は、中央セルからの距離がゼロに相当します。各ドットは、セルの長さに沿って焦点が見つかった場所を表します。すべての密度プロットで、明るい色は高い密度を表し、暗い色は低い密度を表します。鞭毛、走化性、およびカルボキシソームのグラフでは、焦点に最も近い細胞極が左を向いていました。グラフの右半分の焦点は、2 番目の焦点の存在を示します。染色体、カルボキシソーム、鞭毛、および走化性標識変異体のグラフ軸:y 軸範囲 (細胞長): 0.8 ～ 2.1 μm。 x 軸範囲 (中央セルからの距離): -1.1 ～ 1.1 μm。 ΔflhG 細胞の X 軸は 0.5 ～ 1.8 μm です。ディビソームのグラフ軸: y 軸範囲 (セル長): 1.5 ～ 3.0 μm。 x 軸範囲 (中央セルからの距離): -1.5 ～ 1.5 μm。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、ParB-mNG 病巣と SYTOX 染色された核様体のタイムラプス顕微鏡検査を実行し、染色体の分離をリアルタイムで観察しました。新生WT細胞は細胞中央部に単一のParB焦点を持ち、その後、成長細胞の4分の1の位置に向かって双方向に分離する2つの焦点に分割されます（補足図2fおよび補足ムービー1A）。細胞四分の一に位置する病巣は維持され、分裂後の各娘細胞の中央細胞位置となった。推定上の parA 遺伝子 (Hn2335) が削除されると、忠実な染色体の分離と継承が失われました (補足図 2g および補足ムービー 1B)。多くの細胞は、分裂しない細胞極に単一の大きな ParB 焦点を持ち、分裂時にすべての DNA が単一の娘細胞に集中しました。これらの倍数体の娘は分裂を続けましたが、無核の娘はもはや生存できませんでした。これらのデータは、欠失変異体における ParB 病巣強度の増加が、これらの細胞における染色体コピー数の増加を表すことを確認しました。要約すると、Hn2335によってコードされるA/D ATPaseは、忠実な染色体分離に必要であり（図2d）、今後このタンパク質をParAと呼びます。

二分体を適切に配置すると、細胞が分裂するときに両方の娘細胞の長さがほぼ同じになります。 Min システムがないと、核様体のない領域で分裂が起こり 24 、極性分裂の産物である無核ミニ細胞が生成されます。我々のバイオインフォマティクス分析により、Hn1364によってコードされるタンパク質がMinDホモログであり、同じオペロン内のこの遺伝子のすぐ下流にMinEホモログをコードする遺伝子があることが示されました（図2e）。 Hn1364が実際にジビソームの位置決めに関与しているかどうかを判断するために、分裂細胞を分析し、細胞長と比較してそれらの収縮部位を特定しました（図2f、g）。 WT 細胞は細胞中央付近で分裂しましたが (図 2f および補足図 3d)、ΔHn1364 細胞は非対称に分裂しました (図 2g および補足図 3e)。分裂細胞の集団分析により、ΔHn1364細胞のわずか41％と比較して、WT細胞の97％で細胞中央収縮部位が特定されました（補足図3fおよび補足ムービー2）。単一の非対称分裂事象に加えて、ΔHn1364 変異体集団の分裂細胞の 9% が細胞長に沿って複数の分裂部位を同時に形成しました (補足図 3e、補足図 3g、および補足ムービー 2C)。不均等な分裂により、細胞長のばらつきが大きくなりました（補足図3h）。外因性遺伝子座での Hn1364 による補完により、細胞中央収縮と単一分裂イベントが回復しました（補足図 3j）。全体として、我々の発見は、Hn1364がディビソームを細胞中央部に配置するのに重要であることを示しており（図2h）、今後このタンパク質をMinDと呼ぶことにします。

細菌微小区画 (BMC) は、敏感な代謝反応をカプセル化し、原核生物に独特の増殖上の利点を提供する、大きな正二十面体のタンパク質ベースの細胞小器官です。その重要性にもかかわらず、BMC が空間的にどのように制御されているかについてはほとんど知られていません。モデル BMC は、シアノバクテリアとプロテオバクテリアに見られる炭素固定カルボキシソームです26。最近、カルボキシソーム分布維持タンパク質A（McdA）と名付けたA/D ATPアーゼが、H. neapolitanusを含むカルボキシソーム含有細菌に広く普及していることが判明しました（図2i）4。 McdA は、そのパートナータンパク質である McdB27、28 とともに核様体上にカルボキシソームを配置します。カルボキシソームの位置決めの要件を実証するために、カプセル化されたルビスコ酵素 (cbbS) の小サブユニットを mTurquoise2 で標識して CbbS-mTQ を形成することにより、カルボキシソームを視覚化しました。以前に示したように、WT細胞では、カルボキシソームは細胞の長さに沿って分布しています（図2j、補足図4d）。欠失変異体（ΔmcdA）では、カルボキシソーム凝集体は一方の極、または場合によっては両方の極に大きな明るい極焦点を形成します（図2k、補足図4d、e）。外因性遺伝子座での mcdAB による補完により、カルボキシソームの位置が回復されました (補足図 4h)。これらのデータは、変異体集団内の病巣が組み立てられたカルボキシソームの集合体を表すことを示した、TEM を使用した以前の観察と一致しています 28。

ここでは、長期の微速度撮影顕微鏡法を使用して、以前の発見を拡張します。 WT細胞では、カルボキシソームは複数の世代にわたって細胞長に沿って動的に配置されます（補足図4fおよび補足ムービー3A）。欠失変異体では、極性カルボキシソーム凝集体は停滞していました（補足図4gおよび補足動画3B）。まとめると、我々の発見は、カルボキシソームオペロン内にコードされているMcdAと呼ばれるA/D ATPアーゼが、細胞長全体にカルボキシソームを分布させ、分裂後の細胞小器官の恒常性を確保するために不可欠であることを示しています（図2l）。

鞭毛は、細菌の運動性を可能にする外部の糸状構造です。細菌は鞭毛の位置、数、パターンが異なります。多くの細菌は、その鞭毛オペロンに FlhG と呼ばれる A/D ATPase をコードしています。これは、多くの細菌の多様な鞭毛形成パターンに不可欠です 7 が、その機構は依然として不明です (補足説明)。極性鞭毛虫では、flhG を欠失すると、通常、鞭毛の数と運動性が変化します 6、29、30、31、32、33、34。一方、周囲微生物である枯草菌では、flhG の欠失により鞭毛の位置が変化します 35。驚くべきことに、両親媒性生物であるカンピロバクタージェジュニにおける flhG の欠失も細胞分裂欠陥を引き起こします 36,37。

我々のバイオインフォマティクス分析は、鞭毛オペロン内のHn0716がFlhGホモログをコードしていることを示唆しています（図1cを参照）。 Hn0716が鞭毛の空間調節に関与しているかどうかを判断するために、我々はまず、膜の細胞質面に集合する鞭毛基底体の構成要素であるFliNのmNG融合体を視覚化した（図2m）。 WT細胞は、細胞極の端に単一のmNG-FliN焦点を持っていました（図2n）。 ΔHn0716細胞では、FliN病巣はもはや忠実に配置されず（図2o）、細胞は0または複数の病巣を有する可能性が高くなりました（補足図5d）。外因性遺伝子座での Hn0716 による補完により、FliN 病巣の極への局在化が回復しました（補足図 5i）。これらのデータは、H. neapolitanus で単一の鞭毛を単一の極に配置するには Hn0716 が必要であることを示唆しています。

次に、FliNの位置に対するこれらの変化が細胞の運動性に影響を与えるかどうかを判断することに着手しました。軟寒天での運動性アッセイでは、ΔHn0716細胞が運動性ではないことがわかりました（補足図5g）。運動性の喪失は、鞭毛の位置の誤り、鞭毛の喪失、または鞭毛の過多が原因である可能性があります。鞭毛を画像化するために、我々はフラジェリン T185C を設計しました。これにより、システイン反応性マレイミド染色液を培地に添加することで鞭毛の蛍光標識が可能になります 39。我々は、WT H. neapolitanus細胞が単毛性であり、FliN焦点から発する単一の極鞭毛を備えていることを発見しました（補足。図5h）。 ΔHn0716細胞もFliN病巣から発する鞭毛を持っていましたが、細胞は鞭毛が過剰に発達しており、多くの場合複数の鞭毛が房として束ねられ、いくつかのFliN病巣から発していました。我々は、Hn0716がH. neapolitanusの鞭毛の数と位置の調節に必要であると結論付け（図2p）、今後このタンパク質をFlhGと呼ぶことにする。今後の研究では、H. neapolitanusの鞭毛の集合、数、位置、および細胞分裂におけるflhGの独特の多面発現効果を調査する予定です（補足説明）。

細菌の運動性を制御しているのは、走化性クラスターと呼ばれる大きな六角形の配列で、化学受容体、アダプタータンパク質 (CheW)、およびキナーゼ (CheA) で構成されています。走化性クラスターの数と位置の両方を制御するために、A/D ATPase (Vibrio 種では ParC、R. sphaeroides では PpfA と呼ばれる) の使用など、いくつかの機構が進化しました。ビブリオ種では、ParC は走化性アレイを HubP8,40 と呼ばれる極性ランドマークタンパク質に向けます。結果として、娘細胞は細胞分裂時に古い極の配列を継承します。 R. sphaeroides には極性のランドマークはなく、PpfA は核様体全体に走化性クラスターを分布させます 9,41。研究されたところによると、A/D ATPase の欠失により、細胞内の走化性クラスターの数と位置が変化し、その結果、軟寒天中での拡散運動性が低下します。

我々のバイオインフォマティクス分析により、Hn0722によってコードされるタンパク質がH. neapolitanusの走化性オペロン内のParC/PpfAホモログであることが示されました（図1cを参照）。 Hn0722が走化性クラスターの空間的調節に重要であるかどうかを判断するために、最初にmNGをCheYに融合することによって走化性クラスターを画像化しました（図2q）。 CheY は CheA によってリン酸化される応答制御因子であり、大腸菌の走化性クラスターと共局在することが以前に示されています 42,43。 H. neapolitanus 44の走化性クラスターの電子顕微鏡写真と一致して、CheY-mNGは、WT細胞の約85％で1つの細胞極のすぐ近くに単一の焦点を形成しました（図2r、補足図6d）。ただし、Hn0722が削除された場合、CheY-mNGシグナルは細胞集団の約80％に拡散しました（図2s、補足図6d）。 CheY-mNG 焦点を持ったΔHn0722細胞の約20％では、焦点の強度が著しく低かった（補足図6e）。重複遺伝子Hn0722およびHn0723による補完により、極でCheY焦点が回復されました（補足図6f）。まとめると、Hn0722はH. neapolitanusにおける走化性クラスターの構築と位置決めに必要であると結論付け（図2t）、今後このタンパク質をParCと呼ぶことにします。

我々はこれまでに、5 つの A/D ATPase が H. neapolitanus の 5 つの異なる細胞積荷を位置決めすることを示す直接的な証拠を提供しました (図 2)。次に、5 つの位置決め反応がそれぞれ互いに独立して発生するかどうかを尋ねました。この質問に答えるために、カーゴ標識されたすべてのバックグラウンド株の各 A/D ATPase を個別に削除しました (図 3)。我々は、カルボキシソーム（図3c）と鞭毛（図3d）の位置が、離れたA/D ATPアーゼの欠失によってほとんど影響を受けないことを発見しました。興味深いことに、染色体（図3a）、ジビソーム（図3b）、および走化性クラスター（図3e）の位置または焦点強度は、専用のA / D ATPアーゼの欠失と比較した場合に中間の表現型であるにもかかわらず、ΔflhG細胞ですべて影響を受けました（図 3、太字のボックス)。私たちのデータを総合すると、各 A/D ATPase は特定の種類の貨物の測位専用であり、他の貨物の測位には直接関与していないことがわかります。しかし、細胞集団レベルでの我々のデータは、特定の位置決め反応間の潜在的な調整、クロストーク、および/または相互依存性も明らかにしました。次の 3 つのセクションでは、1 つの A/D ATPase によるカーゴの位置決めが、別の A/D ATPase によって位置決めされたカーゴの位置決めおよび継承とどのように間接的に調整できるかを詳しく説明します。

5 つの細胞カーゴのそれぞれに、示されているように蛍光タグが付けられました (左): a 染色体 (ParB-mNG)、b ジビソーム (陥入部位)、c カルボキシソーム (CbbS-mTQ)、d 鞭毛 (mNG-FliN)、および e 走化性クラスター(CheY-mNG)。 (すべての画像) 示されている顕微鏡写真は、少なくとも 3 回の実験からの代表的な画像です。スケールバー: 2 μm。「ラベルのみ」列は、各蛍光カーゴの WT 位置を示します。 A/D ATPase を欠失させると、その特定のカーゴ (太字の四角形) のみが誤って局在化する結果となりました。「標識のみ」列のグラフおよび太字の長方形のグラフは、図 2 から複製されたものです。染色体、カルボキシソーム、鞭毛、および走化性標識変異体のグラフ軸: x 軸の範囲 (細胞長): 0.8 ～ 2.1 μm。 y 軸範囲 (中央セルからの距離): -1.1 ～ 1.1 μm。 ΔflhG 細胞の x 軸はすべて 0.5 ～ 1.8 μm です。ディビソームのグラフ軸: x 軸範囲 (セル長): 1.5 ～ 3.0 μm。 y 軸範囲 (中央セルからの距離): -1.5 ～ 1.5 μm。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ParAは細胞分裂後の染色体の分離と継承に直接必要であるため、parAの欠失により無核細胞のかなりの部分がどのように生じるかを示しました（図4a）。 minD または flhG を削除すると無核細胞が生じますが、そのメカニズムはそれぞれの場合で異なりました。 ΔminD細胞では、染色体の位置（図4b）およびParB焦点の強度（図4c）はWTのものと同様であり、染色体の分離がまだ活発であることを示しています。代わりに、非対称な染色体継承と無核細胞の形成を間接的に引き起こしたのは、ΔminD細胞における二分体の位置の誤りとその後の非対称な細胞分裂でした（図4d）。

a 染色体 (parA)、ジビソーム (minD)、または鞭毛 (flhG) の位置決めに必要な A/D ATPase が欠失すると、無核細胞 (灰色のボックス) が生じます。 b ΔparA 細胞のみが ParB 病巣の位置を誤っていました。単一の ParB フォーカスを持つセルは赤で表示されます。 2 つの ParB 焦点を持つ細胞は黒色です。 ΔflhG 細胞は長い細胞内で単一の ParB フォーカスを維持しており、DNA 複製欠陥を示唆しています。 c ParB 焦点は、ΔparA 細胞内でのみ明るくなります。 WT: n = 1289; ΔparA: n = 773; ΔminD: n = 990; ΔflhG: n = 747 の生物学的に独立した細胞。クラスカル・ウォリス p 値: ΔparA: <0.0001; ΔminD: 0.97; ΔflhG: 1. d minD または flhG の欠失により、二分体の位置のずれが生じました。狭窄部位は、長軸に沿って細胞中心の 5% 以内に見られる場合、「細胞中央部」とみなされました。 WT: n = 6; ΔparA、ΔminD、およびΔflhG: n = 5 生物学的に独立したサンプル。 Brown-Forsythe および Welch ANOVA 検定の p 値: ΔparA: 0.28; ΔminD: <0.0001; ΔflhG: <0.0001 e flhG の欠失は、ΔminD と比較した場合、ディビソームの位置決めに対して中間の影響をもたらしました。密度グラフ上の各ドットは、特定された 1 つの狭窄部位を表します。明るい色は密度が高く、暗い色は密度が低いことを表します。パネル b および e は図 3 から要約されています。(すべての画像) スケールバー: 2 μm。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ΔflhG細胞では、染色体の位置（図4b）およびParB焦点の強度（図4c）もWTのものと同様であり、やはり染色体の分離が影響を受けていないことを示唆しています。しかし、二分体の位置ずれはΔminD細胞ほど深刻ではなく（図4d、e）、これは無核細胞が3番目の異なるメカニズムを介して形成されていることを示唆しています。興味深いことに、ΔflhG 細胞は WT 細胞と比較して 2 つの ParB 病巣を持つ可能性が低かった (図 4a)。代わりに、分裂前の細胞には依然として単一の ParB 焦点があり (図 4b)、その強度は単一の染色体コピーのみの存在を示唆していました (図 4c)。微速度撮影顕微鏡法により、ParB 焦点の位置が積極的に維持されていることを確認しました (補足ムービー 4)。したがって、無核ΔflhG 細胞は、染色体の複製および/または早期細胞分裂の欠陥により形成される可能性があります。今後の勉強の問題。

まとめると、これらの発見は、同じ生物体に存在する場合、A/D ATPase 相互の機能的関係や細菌の細胞周期を調査することの重要性を強調しています。

McdA は、カルボキシソームを分布させるための位置決めマトリックスとしてヌクレオイドを使用します 27,28。したがって、ΔparA変異体集団において、すべての無核細胞がカルボキシソームを保持していたことは驚くべきことでした（図5a）。無核細胞がカルボキシソームを新たに合成したか、またはカルボキシソームが分裂後も何らかの形でまだ受け継がれているかどうかを判断するために、蛍光カルボキシソームを使用してΔparA細胞のタイムラプス顕微鏡検査を実行しました（図5bおよび補足ムービー5A）。興味深いことに、無核細胞は実際にカルボキシソームを継承しましたが、その方法は最も予想外でした。 ParB 焦点を分割できなかった分裂中の ΔparA 細胞では、無核となる予定の細胞内のカルボキシソームが分裂面のすぐ隣で束ねられました。カルボキシソームのバンドリングは、完全な分裂と非対称な染色体継承の直前に陥入中隔で起こる染色体のスプール作用と一致しました（補足図2gおよび補足ムービー1Bを参照）。分離が完了した後、大規模なカルボキシソーム束が無核細胞の新しい極から爆発的に解放され、その結果、複数の自由に拡散するカルボキシソーム焦点が生じました（図5bおよび補足ムービー5A）。カルボキシソームを保持する無核細胞はそれ以上分裂しませんでした。 ΔminD（図5cおよび補足ムービー5B）およびΔflhG（図5dおよび補足ムービー5C）細胞集団の無核細胞も、同じメカニズムを介してカルボキシソームを継承することがわかりました。これらのデータを総合すると、McdA によるカルボキシソームの輸送と配布が忠実な染色体分離にどのように依存しているかを示しています。ただし、カルボキシソームは隔壁中に陥入部位を通して巻き取られる誤って分離された染色体から削り取られるため、無核細胞は parA、minD、または flhG 欠失株でもカルボキシソームを継承する可能性があります。我々は、非対称に遺伝した核様体を位置決め行列として使用するすべてのメソスケールのカーゴが同じ遺伝様式を示すと推測しています。

a カルボキシソームは無核細胞 (破線の円) に存在します。示されている顕微鏡写真は、2 つの実験からの代表的な画像です。 b 微速度顕微鏡検査では、ΔparA 細胞のカルボキシソーム (緑色) が核様体に結合しているが、押し出された染色体からの放出を介して無核細胞に受け継がれていることが示されています。カルボキシソームは、同じメカニズムを介して c ΔminD 無核細胞および d ΔflhG 無核細胞にも受け継がれます。 (すべてのビデオ) 白い矢印は、カルボキシソームのバンドルとその後の放出を強調表示します。スケールバー: 1 μm。

Rhodobacter sphaeroides の走化性クラスターの位置を決定する A/D ATPase は、位置決めマトリックスとして核様体を使用します 41。したがって、我々は、無核細胞をもたらすA/D ATPase欠失が、これらの菌株における走化性クラスターの空間制御に間接的に影響を与えるのではないかと考えた。実際、parA、minD、およびflhG欠失株はすべて無核細胞を形成しており（図4aを参照）、それに対応して走化性クラスターを欠く細胞が増加し（図6a）、細胞に病巣がある場合、それらはWTと比較して特に薄暗くなります（図6b）。

parA、minD、または flhG の欠失は走化性クラスターに影響を与えます (WT: n = 4、ΔparA: n = 4、ΔminD: n = 5、ΔmcdA: n = 4、ΔflhG: n = 4、ΔparC) : n = 4 生物学的に独立したサンプルブラウンフォーサイスおよびウェルチ ANOVA 検定の p 値: ΔparA: 0.0013、ΔminD: 0.0642、ΔmcdA: 0.1141、ΔflhG: 0.0043、ΔparC: 0.0012) および b アセンブリ (n =生物学的に独立した細胞 455 個、クラスカル・ウォリス検定 p 値: ΔparA: <0.0001、ΔminD: <0.0001、ΔmcdA: <0.0171、ΔflhG: <0.0001、ΔparC: <0.0001)。 flhG の欠失のみが鞭毛 c 数と d 集合に実質的な影響を与えた (n = 851 生物学的に独立した細胞。クラスカル・ワリス検定 p 値: ΔparA: 0.1161、ΔminD: 0.4433、ΔmcdA: 0.0184、ΔflhG: <0.0001、Δ parC: 0.0051)。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ΔparAおよびΔminD株は走化性クラスターの集合に対して中程度の効果を示しましたが、flhGの欠失はより深刻であったことに留意することが重要です（図6a、b）。走化性クラスターが鞭毛と通信して細菌を好ましい条件に向けて移動させることを考えると、H. neapolitanus における走化性クラスターの集合と組織化は鞭毛の位置によって制御されていると仮説を立てます。興味深いことに、parC の欠失は鞭毛巣の数 (図 6c) または鞭毛基底体の強度 (図 6d) に最小限の影響しか及ぼさなかったため、この効果は相反的ではありませんでした。鞭毛および走化性クラスターの空間制御におけるこのクロストークの原因となる分子プレーヤーを特定することは、今後の研究の課題である。まとめると、我々のデータは、A/D ATPase がタンパク質ベースの細胞小器官の位置を相互に調整する方法や、DNA 分離と細胞分裂のプロセスにおける相互依存性を示しています。

我々は、複数の A/D ATPase が共存し、同じ細胞内で複数の異なるカーゴの位置を調整していることを実験的に実証しました。また、A/D ベースの測位が貨物固有であることも示しました。 A/D ATPアーゼは、非常によく似たサンドイッチ二量体構造を形成することが示されており45、46、47、48、AlphaFold2（AF2）予測は、これがここで研究されたH. neapolitanusの5つのA/D ATPアーゼすべてに当てはまることを示唆しています（補足図1）。 7a-b)。構造的類似性は、A/D ATPアーゼをその特定のカーゴに結び付ける特異性を提供する、各A/D ATPアーゼに固有の保存された界面が存在することを示唆しています。

AF2 と Rosetta の予測を使用して、H. neapolitanus の A/D ATPase 構造を決定し、各位置決め反応に特異性をもたらす推定上の相互作用界面を特定しました。 A/D ATPase には特異性を与える 3 つの界面があります: (1) 二量体化界面、(2) 位置決めマトリックス (核様体または膜) との相互作用のための界面、および (3) パートナータンパク質との相互作用のための界面、最終的に ATPase をそのカーゴに結び付けます。我々は、H. neapolitanusの5つのA / D ATPaseすべてに対するこれら3つのインターフェースを特定し（図7）、これらの関連に必要な重要な残基を予測しました（補足データ3）。

a H. neapolitanus の A/D ATPase のホモ二量体構造は、AlphaFold2 (シアン) を使用して生成されました。ホモ二量体特異性の推定上の残基はマゼンタで強調表示されます。 b a からの二量体は、それらの位置決めマトリックス (ヌクレオイド DNA または膜) 上に配向されます。ヌクレオイド DNA または膜の結合に重要な推定上の残基は赤色で強調表示されます。 c 推定パートナータンパク質 (オレンジ) の N 末端相互作用ペプチドとドッキングした二量体構造。これによりカーゴ特異性が付与されます。ズームボックス: この結合に重要であると予測される残基は、ATPase 上のスペースが詰まったシアンとパートナータンパク質上のオレンジです。

二量体界面の特異性により、A/D ATPアーゼはホモ二量体化に制限され、それにより各A/D ATPアーゼが同一細胞内で相互干渉することなく独立して機能することが可能になります（図7a）。 H. neapolitanus における 5 つの A/D ATPase のホモ二量体化に必要な推定残基は、補足データ 3、表 1 に示されています。 1.

ParA 様 ATPase は核様体を使用し、MinD 様 ATPase はカーゴの位置決めに内膜を使用します。 ParA、McdA、およびParCは、ヌクレオイドDNAへの非特異的結合のための塩基性残基をC末端に持っていますが、MinDおよびFlhGは、膜結合のための膜標的配列（MTS）を持っています（図7b）。各 A/D ATPase がそれぞれの位置決め行列と結合するために必要な予測残基を特定しました (補足データ 3、タブ 2)。

A/D ATPase に対する貨物の特異性は、貨物と会合するパートナータンパク質、または貨物自体の物理的構成要素であるパートナータンパク質との相互作用によってもたらされます。パートナータンパク質の N 末端には、A/D ATPase とのみ相互作用する荷電残基が豊富に含まれる一連のアミノ酸があり、パートナータンパク質の残りの部分はカーゴ会合に専念します 49。我々は、各A/D ATPアーゼとそのパートナータンパク質のN末端ペプチドとのドッキングモデルを作成しました（図7c）。ペプチドは、推定上のパートナータンパク質の N 末端からの最初の 30 残基として定義されました。ペプチドドッキングシミュレーションにより、A/D ATPase とそのパートナータンパク質の間のシステム特異性の鍵となるいくつかの推定残基が特定されました (補足データ 3、タブ 3)。

最後に、同族 A/D ATPase にドッキングされたパートナータンパク質の N 末端ペプチドの相互作用界面を構成するすべての残基にわたって、アラニンスキャニング突然変異誘発をインシリコで実行しました (補足データ 3、タブ 4)。得られたΔΔG 値は、各残基がパートナータンパク質とその同族 A/D ATPase との相互作用の安定性にどの程度寄与しているかを特定します。重要なことに、私たちのインシリコアラニン置換シミュレーションでは、大腸菌MinEペプチドをMinD二量体にドッキングするために重要であることが実験的に示されたすべての残基47、50、51を特定しました（補足図7c）。我々のインシリコデータを総合すると、戦略的突然変異誘発と、細菌の染色体分離、細胞分裂の位置決め、原核生物にわたるA/D ATPaseによるタンパク質ベースの細胞小器官輸送に関与する特異性決定因子の機構的探索のためのロードマップが提供される。

A/D ATPase の研究は、特定の生物学的プロセスの特定の積荷に焦点を当てており、主に 1 つまたは 2 つの A/D ATPase のみをコードするモデル生物に焦点を当てています。これらの研究では通常、特定の貨物はどのようにして正しい位置を見つけるのか、そしてこの位置は時間の経過とともにどのように変化するのかという 2 つの疑問が提起されます。ここでは、特定の貨物の種類や生物学的プロセスではなく、測位システムに焦点を当てました。したがって、私たちのシステム生物学的アプローチは、複数の A/D ATPase が同じ細胞内の多様なカーゴの位置をどのように調整するかに取り組みます。

複数の A/D ATPase のエンコードは、原核生物間で共通の機能です。我々は、配列決定されたすべての細菌ゲノムの3分の1以上が複数のA/D ATPアーゼをコードしており（図1a）、一部の細菌は10を超えるA/D ATPアーゼをコードしていることを発見した。興味深いことに、ほとんどの細菌は同じ基本的な積荷を持っていますが、すべての細菌が専用の A/D ベースの測位システムを使用しているわけではありません。たとえば、H. neapolitanus などの特定の細菌では A/D ATPase によって配置されることがここで発見された細胞カーゴの多くは、大腸菌などの他の細菌では A/D ATPase によって積極的に配置されません。特定の細胞積荷をある細菌に配置し、別の細菌には配置しないために A/D ATPase が必要な理由は、未解決の疑問のままです。ただし、細菌がコードできる A/D ATPase の数には制限があるようです。 A/D ATPase は古細菌ゲノムにもコードされています 52 が、細胞内組織における A/D ATPase の役割についてはほとんど知られていません。最近の研究では、いくつかの門、特に真古細菌門にわたる古細菌種が複数の A/D ATPase をコードしていることが示されました 53。これらの種のいくつかには、13 個の A/D ATPase を持つ H. volcanii など、12 個以上の A/D ATPase が含まれており、そのうち 4 個は MinD 相同体でした。驚くべきことに、4 つの MinD ホモログはすべて細胞分裂の位置決めに必要ではありませんでしたが、1 つ (MinD4) は走化性アレイと、細菌の鞭毛と機能的に同等である古細菌の形成を刺激しました。この研究は、我々がここで行ったように、A/D ATPase をその細胞積荷に実験的に結び付けることの重要性を強調しています。

ATPase の ParA/MinD ファミリーは、細胞の成長と分裂、DNA 分離、運動性、結合、病因など、原核生物の基本的なプロセスに重要な多様な中規模複合体の増加するリストを時空間的に制御しています 20,21。したがって、A/D ATPase が細胞積荷の正しい位置と正しい時間の配置をどのように調整するかを理解することが、細菌細胞の機能を理解する鍵となります。非病原性モデルとして H. neapolitanus を使用した我々の発見は、各 ATPase が特定の細胞積荷の位置決めに専念しているという考えを強く裏付けています。私たちのモデルはまた、タンパク質ベースの細胞小器官輸送が染色体の忠実な複製と分離に依存していること、また細胞分裂を細胞中央部に配置していることも明らかにしました。たとえば、ParA の欠失の直接的な結果は染色体の分離ミスでしたが、その結果生じる非対称な染色体継承により、カルボキシソームと走化性クラスターの位置決めにおける間接的な欠陥も引き起こされました。また、FlhGによる鞭毛の位置決めにおけるこれまで特徴づけられていなかったエピスタティックな関係と、ParCによる走化性クラスターの空間制御に対するその下流の影響も特定した。走化性クラスターが鞭毛の回転方向を制御することで細胞の運動性を制御することはよく知られています。しかし、私たちの知る限り、鞭毛と走化性クラスターの空間制御におけるクロストークはまだ文書化されていません。今後の研究では、細胞の運動性に関与するこれら 2 つの細胞カーゴの A/D ベースの位置決め間のクロストークに関与する分子プレーヤーが判明するでしょう。

私たちのバイオインフォマティクスにより、H. neapolitanus ゲノム内の 6 番目の A/D ATPase も特定されました。 Hn1669は、VirC1と相同性を示すA/D ATPアーゼであり、共役機構コンポーネントをコードするtrb遺伝子の近くに位置しています（図1b）。単一の研究では、Agrobacterium tumefaciens の Ti プラスミドにコードされている VirC1 ATPase が、細胞極の IV 型分泌機構への接合型 Ti プラスミドの動員に関与していることが示されています 10。興味深いことに、H. neapolitanus では、VirC1 ホモログは統合結合要素 (ICE) 上でコードされており、この A/D ATPase の下流遺伝子は ParB ホモログをコードしています。 ICE は細菌の進化と抗生物質耐性遺伝子の蔓延の主要な推進力です 54。我々はまだ H. neapolitanus における結合を画像化していませんが、この ParB ホモログが結合中に ICE 遺伝子座に結合し、境界を定めるのではないかと考えています。 VirC1 ホモログとその下流の ParB ホモログが、抱合のための細胞極の IV 型分泌機構への ICE 遺伝子座の輸送と位置決めに関与していると推測するのは魅力的です。

A/D ATPase は配列、構造、生化学的共通点を共有していますが、これらの ATPase をカーゴに結び付けるパートナータンパク質は非常に多様です。この多様性のため、パートナータンパク質は常に同定されているわけではなく、その結果、多くの A/D ATPase は「オーファン」と呼ばれています 20。極端な多様性は主に、A/D ATPase をその同族カーゴに結び付ける特異性決定因子を提供するパートナータンパク質によるものです。極度の多様性にもかかわらず、パートナータンパク質は共通のメカニズムを介して A/D ATPase と相互作用し、刺激するという考えが、分野全体のデータによって裏付けられています。プラスミドの分配と染色体の分離に関与するパートナータンパク質、さらにはBMC、鞭毛、走化性クラスター、およびジビソームの位置決めに必要なパートナータンパク質はすべて、正に帯電した無秩序なN を介してA/D ATPaseと相互作用することが示されているか、示唆されています。 -ターミナル49。パートナータンパク質のN末端ペプチドとドッキングしたA/D ATPase二量体のインシリコ解析は、特定のカーゴがどのように割り当てられているか、そしてこれらの関連する位置決めシステムがどのように相互干渉することなく同じ細胞内で共存し機能するかを示しています。

今後は、H. neapolitanus をモデルとして使用して、A/D ATPase ファミリー全体に共有される一般的な輸送モードを定義し、異種の貨物に対して位置決め反応がどのように変化するかを決定することを目指しています。 A/D ATPase は細菌細胞機能の本質的にすべての側面を空間的に組織化するため、これらの発見は重要です。さらなる将来の方向性は、各パートナータンパク質とカーゴについてここで特定した特異性決定因子を実験的に検証し、細菌における位置決めシステムの合理的な設計にこの知識を活用することです。最小限の自己組織化システムは合成生物学にとって不可欠なツールであるため、これらの貢献は重要であると予想されます55。我々は、異種細菌の天然および合成貨物の空間調節因子として使用される「荷物タグ」として、位置決めATPaseとそのパートナータンパク質N末端ペプチドからなる最小自律測位システム（MAPS）を設計することを目指しています。

tBLASTn 分析は、最大ターゲット配列を 5000、E 値閾値を 0.0001 とした RefSeq 代表ゲノムデータベースに対するクエリとして、ParA/MinD コンセンサス配列 (xKGGxxK[T/S]) を使用して行われました。配列相同性を共有し、webFlaG (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32956448/) を使用して確認された、同定された推定上のカーゴ遺伝子の 1 つを含む配列をフィルター処理しました。コンセンサスクエリは COBOLT (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17332019/) を使用して生成されました。

遺伝子近傍の保存を示すために、いくつかの代表的なゲノムが選択されました。複製起点 (OriC) の特定は、Ori-Finder (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-79) を使用して実行されました。 FlaGs 解析図は Gene Graphics (https://katlabs.cc/genegraphics/) を使用して生成されました。

配列は、Clustal Omega を使用してアラインメントされました。結果として得られたツリーは iTOL にインポートされ、ルートのないツリーが生成されました。 (NCBI アクセッション番号: Hn2335—ACX97145.1; Hn1364—ACX96198.1; Hn0912—ACX95755.1; Hn0716—ACX95565.1; Hn0722—ACX95571.1; Hn1669—ACX96495.1; Hn0255—ACX9511 8.1）。

この研究に記載されているすべての変異体は、ATCC から購入した WT Halothiobacillus neapolitanus (Parker) Kelly and Wood (ATCC® 23641™) を使用して構築されました。培養物は、ATCC® Medium 290: Thiobacilli 用 S-6 培地 (Hutchinson et al., 1965) で増殖させ、5% CO2 を補充した空気中で 130 RPM で振盪しながら 30 °C でインキュベートしました。株は 10% DMSO 中で -80 °C で凍結保存されました。

すべての構築物は Gibson Assembly を使用して生成され、シーケンスによって検証されました。アセンブリ用のフラグメントは PCR によって合成されるか、gBlock (IDT) として注文されました。構築物には、標的ゲノム遺伝子座への相同組換えを促進するために、標的挿入部位の上流および下流に長さ 750 ～ 1100 bp の範囲の隣接 DNA が含まれていました。プラスミドのクローニングは、化学的にコンピテントな大腸菌 Top10 または Stellar 細胞 (Takara Bio) で実行されました。

H. neapolitanus のコンピテントセルは、以前に報告されているように生成されました。つまり、1 L の培養物は OD 0.1 ～ 0.15 まで増殖しました。培養物を、4℃、5000×gで20分間遠心分離することによって回収した。ペレットを再懸濁し、0.5容量の氷冷ナノポア水で2回洗浄した。すべての洗浄遠心分離ステップは 3000xg、4 °C で 30 分間実行されました。洗浄後に得られたペレットを、1 × 10-3 容量の氷冷ナノポア水に再懸濁しました。これらのコンピテントセルはすぐに使用するか、将来の使用のために -80 °C で凍結しました。凍結コンピテントセルは使用前に 4 °C で解凍しました。

50 ～ 100 μL のコンピテントセルを 5 μL のプラスミド DNA (1 ～ 5 μg) と混合し、氷上で 5 分間インキュベートしました。次いで、この混合物を、抗生物質を含まない５ｍＬの氷冷Ｓ６培地を含むチューブに移し、氷上で５分間インキュベートした。形質転換体は、5% CO2 を補充した空気中、30 °C、130 RPM で振盪しながら 16 ～ 36 時間かけて回復しました。クローンは、抗生物質を含む選択培地上にプレーティングすることによって選択した。コロニーを再度画線化した。再画線されたコロニーは、PCR によって突然変異について検証されました。

ParB-mNG、mNG-FliN、および CheY-mNG のネイティブ蛍光融合では、蛍光タンパク質 mNeonGreen (mNG) をコードする配列が、GSGSGS リンカーによって分離されたネイティブコード配列の 3' または 5' 領域に結合されました。。 Cbbs-mTQ のネイティブ蛍光融合では、蛍光タンパク質 mTurquoise (mTQ) をコードする配列を、GSGSGS リンカーによって分離されたネイティブコード配列の 3' 領域に結合しました。カナマイシン耐性カセットは、N 末端タグの遺伝子の前、または C 末端タグの遺伝子の後に挿入されました。必要に応じて、プロモーターを複製した。変異体は、50μg/mLのカナマイシンを補充したS6寒天プレート上にプレーティングすることによって選択した。すべての融合は PCR によって検証されました。

Hn2335、Hn1364、Hn0912、および Hn0722 の欠失については、遺伝子をスペクチノマイシン耐性カセットに置き換え、続いて下流遺伝子の複製プロモーターを使用しました。 Hn0716 の欠失は、下流遺伝子をコドン最適化し、このコドン最適化遺伝子の後にスペクチノマイシン耐性カセットを挿入することによって得られました。変異体は、50μg/mLのスペクチノマイシンを補充したS6寒天プレート上にプレーティングすることによって選択した。すべての変異は PCR によって検証されました。

欠失遺伝子（Hn2335、Hn1364、Hn0912、Hn0716、およびHn0722）を個別にPtrcプロモーターの発現下に置き、遺伝子Hn0933とHn0934の間に位置する中性部位に挿入した。変異体は、25 μg/mL クロラムフェニコールを添加した S6 寒天プレート上にプレーティングすることによって選択されました。挿入は PCR によって確認されました。イメージングのために、細胞を OD 0.1 まで増殖させ、0、0.25、1、5、10、および/または 50 μM IPTG で最大 6 時間誘導し、さまざまな時点で補完のためにイメージングしました。 Hn2335 を 50 μM IPTG で 3 時間補完しました。 Hn1364 を 50 μM IPTG で 6 時間補完しました。 Hn0716 は Ptrc プロモーターのリーキーな発現で補完されており、誘導は必要ありませんでした。 Hn0912 および Hn0722 は、これらの遺伝子単独では相補しませんでした。これら 2 つの変異体については、隣接する重複遺伝子、Hn0911-Hn0912 および Hn0722-Hn0723 を含む追加の構築物が作成されました。構築物は、上で詳述したように生成、検証、誘導、および画像化された。 Hn0911-Hn0912 に 50 μM IPTG を 3 時間補充しました。 Hn0722-Hn0723 に 50 μM IPTG を 3 時間補充しました。

すべての生細胞顕微鏡検査は、指数関数的に増殖する細胞を使用して実行されました。 3 ～ 5 μL の細胞を 2% UltraPure アガロース (Invitrogen、カタログ番号 16500) + S6 パッドに滴下し、35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek、カタログ番号 P35G-1.5-14-C) 上でイメージングしました。。すべての蛍光および位相コントラストイメージングは、SOLA 365 LED 光源、100X 対物レンズ (位相コントラスト用のオイル CFI Plan Apochromat DM Lambda シリーズ)、および測光システムを備えた NIS Elements ソフトウェアによって制御される Nikon Ti2-E 電動倒立顕微鏡を使用して実行されました。 Prime 95B 裏面照射型 sCMOS カメラまたはハママツ Orca Flash 4.0 LT + sCMOS カメラ。 ParB-mNG、mNG-FliN、および CheY-mNG は、「GFP」フィルターセット (C-FL GFP、ハードコート、高信号対雑音比、ゼロシフト、励起: 470/40 nm [450-490]) を使用してイメージングされました。 nm]、発光: 525/50 nm [500-550 nm]、ダイクロイックミラー: 495 nm)。 CbbS-mTQ 標識カルボキシソームは、「CFP」フィルターセット (C-FL CFP、ハードコート、高信号対雑音比、ゼロシフト、励起: 436/20 nm [426-446 nm]、発光: 480/ 40nm[460-500nm]、ダイクロイックミラー：455nm）。 DAPI 蛍光は、標準「DAPI」フィルターセット (C-FL DAPI、ハードコート、高信号対雑音比、ゼロシフト、励起: 350/50 nm [325-375 nm]、発光: 460/50 nm) を使用して画像化されました。［435～485nm］、ダイクロイックミラー：400nm）。 Alexa Fluor 594 C5 マレイミド結合鞭毛は、「TexasRed」フィルターセット (C-FL テキサスレッド、ハードコート、高信号対雑音比、ゼロシフト、励起: 560/40 nm [540-580 nm]) を使用してイメージングされました。発光: 630/75 nm [593-668 nm]、ダイクロイックミラー: 585 nm)。

多世代タイムラプス顕微鏡法では、1.5% UltraPure アガロース (Invitrogen、カタログ番号 16500) + S6 パッドを 35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek、カタログ番号 P35G-1.5-14-C) にキャストしました。ディッシュを30℃、5% CO2中で少なくとも24時間プレインキュベートしました。 4μlの指数関数的に増殖する細胞を寒天パッド上にスポットしました。温度、湿度、CO2濃度はTokai Hit Incubation Systemで管理しました。画像取得には NIS Elements ソフトウェアを使用しました。画像取得前に、細胞をステージ上部で少なくとも 30 分間プレインキュベートしました。ビデオは 2.5 ～ 5 分あたり 1 フレームで 12 ～ 24 時間撮影されました。

各変異体についていくつかの視野が捕捉されました。すべての蛍光チャネルは、フィジー上で回転ボール半径 50 μm でバックグラウンド減算を受けました。バックグラウンドを差し引いた蛍光画像と位相コントラスト画像を結合して、画像解析に使用する合成画像を作成しました。細胞の同定、細胞長の定量化、病巣の局在化、病巣の数、病巣の蛍光強度、および狭窄部位の同定を含む画像解析は、Fiji プラグイン MicrobeJ 5.13I56,57 を使用して実行されました。セル周囲の検出とセグメンテーションは、許容値 56 のデフォルトのしきい値設定を持つ棒状記述子を使用して実行されました。Maxima 検出パラメータは貨物ごとに個別に設定されました。 ParB-mNG (貨物 = 染色体) 病巣検出の場合、許容誤差と Z スコアは両方とも 100 に設定されました。 CheY-mNG (貨物 = 走化性) 病巣検出の場合、許容誤差は 150 に設定され、Z スコアは 100 に設定されました。 mNG-FliN (カーゴ = 鞭毛) 病巣検出、許容値は 710、Z スコアは 69 に設定されました。 CbbS-mTQ (カーゴ = カルボキシソーム) 病巣検出では、病巣検出の代わりに点検出が使用され、許容値が設定されました結果は実験エディターを使用して手動で検証され、セグメント化されていないセルは粒子カッターを使用して切断されました。各株の関連性、形状記述子、プロファイル、および局在化が記録されました。ローカリゼーショングラフは MicrobeJ を通じて自動的に生成されました。蛍光強度グラフおよび焦点数カウントグラフは、GraphPad Prism (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ、www.graphpad.com) で作成しました。

細胞を５０００ｇで５分間遠心分離することによって回収した。遠心分離後、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。得られた細胞ペレットを１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、最終濃度５００ｎＭのＳｙｔｏｘＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ３４８６２）で染色した。サンプルを暗所、室温で 5 ～ 10 分間インキュベートしました。染色した細胞を、500 nM SytoxBlue を注入した S6 寒天パッドに直接ロードしました。

2 分間で 11 個のフレームがキャプチャされました。カルボキシソームを各フレームでカウントしました。細胞ごとに計数された最大数をカルボキシソーム計数に使用した。

運動性アッセイは、0.4% 寒天中の S6 で実行されました。細胞をS6培地のプレート上で増殖させた。個々のコロニーを運動培地のチューブまたはプレートに接種し、5% CO2 を補充した空気中で 30 °C でインキュベートしました。チューブとプレートの運動性を 2 週間毎日チェックしました。

H. neapolitanus フラジェリンは、Bacillus subtilis 由来の Hag をクエリとして使用した BLAST 相同性検索を使用して同定されました。フラジェリン遺伝子は 1 つだけ見つかりました。いくつかのスレオニンおよびセリン残基がシステイン変異誘発の対象とされました。 Q5 部位特異的突然変異誘発キット (NEB、E0554S) を使用して残基を突然変異させました。クローンは配列決定によってシステイン変異について検証されました。

Alexa Fluor 594 C5 マレイミド色素 (Invitrogen、A10256) を 10 mM の使用濃度まで DMSO に再懸濁しました。 H. neapolitanus 培養物を OD 0.1 ～ 0.2 まで増殖させました。培養物は、ＰＢＳ、ｐＨ１１．７を使用してｐＨ７．０に調整した。次に、pH 7.0 に調整した細胞を、最終色素濃度 100 μM の Alexa Fluor 594 C5 マレイミド色素で染色しました。染色培養物を 4 °C で一晩インキュベートしました。染色された細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で４回以上洗浄した。すべての遠心分離ステップは 5000 × g で 3 分間実行されました。

蛍光強度や細胞長の測定などの集団全体の分析では、ノンパラメトリック Wilcoxon (Kruskal-Wallis) 検定とそれに続くダンの多重比較検定を実行しました。病巣数や細胞中央収縮部位の存在などの集団分析のパーセントについては、集団を別の視野として分析し、集計値を別のデータポイントとしてプロットしました。次に、ブラウンフォーサイスおよびウェルチの ANOVA 検定を実行し、続いてダネットの T3 多重比較検定を実行しました。すべての分析の実行には、GraphPad Prism (バージョン 9.5.1) を使用しました。 P 値スタイル: 0.1234 (ns)、0.0332 (*)、0.0021 (**)、0.0002 (***)、< 0.0001 (****)。

映画はフィジーを使用してトリミングされました。ムービーは、HyperStackReg と呼ばれるマルチチャンネルハイパースタックアライメントプラグインを使用して安定化されました。タイムスタンプとスケールバーの注釈はフィジーを使用して追加されました。矢印と一時停止は、Adobe Premier Pro を使用して追加されました。

MinD および McdA については、AlphaFold の CollabFold 実装を使用して N 末端ペプチドと ATPase のドッキングモデルを生成しました 258,59。 N 末端ペプチドは、推定上のパートナータンパク質の N 末端からの最初の 30 残基として定義されました。 MMseqs2 を使用して複数の配列アラインメントを構築しました。各ペプチド-ATPase ペアについて、各モデルのリサイクル数を 12 に増やして保存されたデフォルトの CollabFold/AlphaFold2 ハイパーパラメータを使用して 5 つの構造を生成しました。 Alphafold2 のデフォルトとして、構造は Amber99sb 力場を使用して AMBER でエネルギー的に最小化されました。我々は、結合界面残基のpLDDTスコアと、以前に解明されたParA様ATPアーゼ/パートナータンパク質結晶構造との類似性に基づいて、ドッキングペプチドモデルを選択した。

ParA、FlhG、および ParC については、Rosetta の FlexPepDock プロトコル 60 を使用してドッキングペプチドモデルを生成しました。まず、AlphaFold2 から生成された ATPase ホモダイマー構造を、lbfgs_armijo_nonmonotone ミニマイザーを使用したデカルト座標空間最小化を伴う FastRelax 全原子リファインメントプロトコルを使用して、ref2015_cart_cst ロゼッタ力場に対して平衡化しました。 AlphaFold2 によって予測されたバックボーン原子の位置を保存するために、バックボーン原子の座標制約が追加されました。この最初のステップでは、ペプチドドッキングステップに使用されるスコアが最も低い構造を持つ 20 個の軌道を生成しました。 FlexPepDock プロトコルの低解像度および高解像度のドッキングステップでは、score3 と docking_cen.wts_patch および REF2015 の力場をそれぞれ使用しました。それぞれの推定パートナータンパク質/ATPase ペアについて、50,000 のドッキング軌跡をシミュレートしました。次に、最も低いエネルギー学によって定義された上位 2,000 の軌道が、Calibur61 を使用してクラスター化されました。次に、クラスター情報、エネルギー論、および機構の妥当性に基づいて最終モデルを選択しました。 Rosetta および Alphafold2 シミュレーションから選択された最終的なドッキングモデルから、インシリコのアラニン変異スキャンと ΔΔG 計算を通じて重要な結合残基を特定しようとしました。我々は、ドッキングペプチドのすべての界面残基を繰り返し変異させ、talaris2014 Forcefield62を備えたRosettaのFlexDDGプロトコルを使用してΔΔGを計算しました。 FlexDDG では、各変異について、Rosetta のモンテカルロバックラブ法を使用して主鎖と側鎖の立体構造が 35,000 回サンプリングされました。 2500 サンプル間隔ごとに、突然変異の ΔΔG が計算されました。最終的に報告されるΔΔG は、35 個のそのような軌道の平均です。

(NCBI アクセッション番号: ParA パートナータンパク質 (ParB) - ACX97144.1; MinD パートナータンパク質 (MinE) - ACX96199.1; McdA パートナータンパク質 (McdB) - ACX95754.1; FlhG パートナータンパク質 (FliA) - ACX95566.1; ParCパートナータンパク質 (CheW) - ACX95572.1)。 AlphaFold2 (MinD、McdA) または Rosetta (ParA、FlhG、ParC) を使用して、各パートナータンパク質の N 末端の最初の 30 アミノ酸をインシリコで二量体構造にドッキングしました。結合界面は、最小 1 オングストローム 2 の表面積を共有する残基によって定義されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

細菌ゲノムは NCBI RefSeq データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) から取得しました。 Protein Data Bank (PDB) から得られた実験的に決定された ParA/MinD ATPase 構造: ParA (5U1G); マクダ (6NOP); ParC (5U1G); MinD (3Q9L); FlhG(4RZ3)。この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。ソースデータもこのペーパーに付属しています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。ソースデータもこのペーパーに付属しています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この研究中に生成されたコードは、GitHub で入手できます: BLAST を使用した細菌の ParA/MinD ATPase の識別 (https://github.com/krthkkrv/Multiple-ParA-MinD-ATPase-coodyne-the-positioning-of-disparate-cargos) -in-a-bacteria-cell)63、AlphaFold2 と Rosetta を使用した H. neapolitanus の各 ParA/MinD ATPase の特異性決定基の同定 (https://github.com/jilimcaoco/Multiple-ParA-MinD-ATPase)64。

Baxter, JC & Funnell, BE プラスミド分割メカニズム。微生物。スペクトル。 https://doi.org/10.1128/microbiolspec.PLAS-0023-2014 (2014)。

Jalal、ASB および Le、TBK ParABS システムによる細菌の染色体分離。バイオルを開きます。 10、200097 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lutkenhaus, J. 細菌の MinCDE システムの集合動態と Z リングの空間制御。アンヌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 76、539–562 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Maccready, JS & Vecchiarelli, AG モデル細菌細胞小器官であるカルボキシソームの位置決め。 MBio 12、e02519–e02519 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Savage, DF、Afonso, B.、Chen, AH & Silver, PA 細菌性炭素固定機構の空間的に秩序化されたダイナミクス。サイエンス 327、1258–1261 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

シューマッハ、JS 他 MinD 様 ATPase FlhG は、C リング構築中の細菌の鞭毛の位置と数に影響を与えます。手順国立アカデミー。科学。 USA 112、3092–3097 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schuhmacher、JS、Thormann、KM、Bange、G. 細菌はどのようにして鞭毛の位置と数を維持しているのでしょうか? FEMS 微生物。改訂 39、812–822 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ringgaard, S.、Schirner, K.、Davis, BM & Waldor, MK ParA 様 ATPase ファミリーは、走化性タンパク質の極局在化を促進することによって細胞極の成熟を促進します。遺伝子開発 25、1544–1555 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thompson, SR、Wadhams, GH、Armitage, JP 細菌における細胞質タンパク質クラスターの位置。手順国立アカデミー。科学。アメリカ合衆国。 103、8209–8214 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Atmakuri, K.、Cascales, E.、Burton, OT、Banta, LM & Christie, PJ アグロバクテリウム ParA/MinD 様 VirC1 は、初期の接合 DNA 転移反応を空間的に調整します。 EMBO J. 26、2540–2551 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shan, S. ATPase および GTPase タンゴは細胞内タンパク質輸送を促進します。トレンド生化学。科学。 41、1050–1060 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hester, CM & Lutkenhaus, J. Soj (ParA) DNA 結合は保存されたアルギニンによって媒介され、プラスミドの分離に不可欠です。手順国立アカデミー。科学。 USA 104、20326–20331 (2007)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kiekebusch, D.、Michie, KA、Essen, L.-O.、Löwe, J. & Thanbichler, M. 局所的な二量体化とヌクレオイド結合は、細菌の細胞分裂阻害剤 MipZ による勾配形成を促進します。モル。セル 46、245–259 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szeto, TH、Rowland, SL、Rothfield, LI & King, GF MinD の膜局在化は、真正細菌、古細菌、および葉緑体にわたって保存されている C 末端モチーフによって媒介されます。手順国立アカデミー。科学。 USA 99、15693–15698 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, ZL & Lutkenhaus, J. MinD の C 末端の保存された配列は、膜に結合し、MinC を隔壁に標的化するために必要です。モル。微生物 47、345–355 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vecchiarelli, AG et al. 動的なP1 ParA-DNA相互作用のATP制御：プラスミド分割におけるヌクレオイドの重要な役割。モル。微生物。 78、78–91 (2010)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koonin, EV 古典的または逸脱した ATP 結合モチーフを含む、多様な機能を持つ ATPase のスーパーファミリー。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 229、1165–1174 (1993)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tilly, K.、Checroun, C. & Rosa, PA Borrelia burgdorferi プラスミド維持の要件。プラスミド 68、1–12 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Livny, J.、yamaichi, Y. & Waldor, MK 細菌におけるセントロメア様 parS 部位の分布: 比較ゲノミクスからの洞察。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 189、8693–8703 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lutkenhaus, J. ParA/MinD ファミリーは物事を適切な場所に置きます。トレンド微生物。 20、411–418 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vecchiarelli, AG、Mizuuchi, K. & Funnell, BE 生物学的表面のサーフィン: 細菌内の分配と輸送のための核様体の利用。モル。微生物。 86、513–523 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saha, CK、Sanches Pires, R.、Brolin, H.、Delannoy, M. & Atkinson、GC FlaG および webFlaG: 遺伝子近傍保存の分析による新しい生物学の発見。バイオインフォマティクス 37、1312–1314 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Raskin, DM & De Boer, PAJ 大腸菌の中央への分裂の指示に必要なタンパク質の急速な極間振動。手順国立アカデミー。科学。 USA 96、4971–4976 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, X. & Margolin, W. min およびパーティション変異体における FtsZ リングクラスター: FtsZ リングの局在化の調節における Min システムと核様体の両方の役割。モル。微生物 32、315–326 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kerfeld, CA、Aussignargues, C.、Zarzycki, J.、Cai, F. & Sutter, M. 細菌の微小区画。ナット。 Rev.Microbiol. 16、277–290 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Turmo, A.、Gonzalez-Esquer, CR & Kerfeld, CA カルボキシソーム: CO2 固定のための代謝モジュール。 FEMS 微生物。レット。 364、18 (2017)。

マクレディ、JS 他核様体上のタンパク質勾配は、シアノバクテリアの炭素固定細胞小器官の位置を決定します。 Elife 7、e39723 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

MacCready, JS、Tran, L.、Basala, JL、Hakim, P. & Vecchiarelli, AG McdAB システムは、プロテオバクテリアの α-カルボキシソームを位置決めします。モル。微生物。 00、1–21 (2021)。

Google スカラー

Campos-García, J.、Nájera, R.、Camarena, L. & Soberón-Chávez, G. 細菌の運動性の調節に関与する緑膿菌 motR 遺伝子。 FEMS 微生物。レット。 184、57–62 (2000)。

論文 PubMed Google Scholar

Dasgupta, N.、Arora, SK、Ramphal, R. fleN、緑膿菌の鞭毛数を調節する遺伝子。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 182、357–364 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, T.、Shi, M.、Ju, L. & Gao, H. FlhFG の研究により、Shewanella oneidensis の鞭毛極性の制御における FlhF の明確な特徴が明らかになりました。モル。微生物。 98、571–585 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

楠本明ほか Vibrio alginolyticus における極鞭毛の数と局在を制御するための FlhF と FlhG の共同研究。微生物 154、1390–1399 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

楠本明ほか Vibrio alginolyticus における flhF および flhG 遺伝子による極鞭毛数の制御。Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 139、113–121 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Arroyo-Pérez、EE & Ringgaard、S. FlhF と FlhG の相互依存性極局在化と腸炎ビブリオの鞭毛形成に対するそれらの重要性。フロント。微生物。改訂 0、557 (2021)。

Google スカラー

Guttenplan, SB、Shaw, S. & Kearns, DB 枯草菌の周鞭毛の細胞生物学。モル。微生物。 87、211–229 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Balaban, M. & Hendrixson, DR 極性鞭毛生合成と鞭毛数の調節因子は、カンピロバクタージェジュニの細胞分裂の空間パラメーターに影響を与えます。 PLOS パトス。 7、e1002420 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガルブロンソン、CJ 他 FlhG は多様な固有ドメインを採用し、FlhF GTPase 活性に影響を与えて、カンピロバクタージェジュニの極鞭毛生合成を数値的に制御します。モル。微生物。 99、291–306 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chang、Y.ら。細菌のべん毛モーターの回転スイッチングの分子機構。ナット。構造体。モル。バイオル。 27、1041–1047 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kühn、MJ et al. 細菌の鞭毛内に複数のフラジェリンが空間的に配置されることで、さまざまな環境での運動性が向上します。ナット。共通。 9、1–12 (2018)。

記事 Google Scholar

Ringgaard, S. et al. ParP は、CheA が走化性シグナル伝達アレイから解離するのを防ぎ、それらを極性アンカーにつなぎます。手順国立アカデミー。科学。 USA 111、E255–E264 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Roberts, MAJ、Wadhams, GH、Hadfield, KA、Tickner, S. & Armitage, JP ParA 様タンパク質は、非特異的な染色体 DNA 結合を使用してタンパク質複合体を分割します。手順国立アカデミー。科学。 USA 109、6698–6703 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kentner, D. & Sourjik, V. 大腸菌走化性経路におけるタンパク質相互作用の動的マップ。モル。システム。バイオル。 5、238 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sourjik, V. & Berg, HC 蛍光タンパク質融合体を使用した大腸菌の走化性機構の構成要素の局在化。モル。微生物。 37、740–751 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブリーゲル、A. et al. 細菌の化学受容体アレイの普遍的なアーキテクチャ。手順国立アカデミー。科学。 USA 106、17181–17186 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leonard, TA、Butler, PJ & Löwe, J. 細菌の染色体分離: 保存された生物学的スイッチである Soj 二量体の構造と DNA 結合。 EMBO J. 24、270–282 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunham, TD、Xu, W.、Funnell, BE & Schumacher, MA P1 および P7 ParA による ADP 媒介転写制御の構造基盤。 EMBO J. 28、1792–1802 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, W.、Park, K.-T.、Holyoak, T. & Lutkenhaus, J. MinD-ATP 複合体の構造の決定により、膜上の MinD の配向と MinE の結合部位の相対位置が明らかになるそしてミンC。モル。微生物。 79、1515–1528 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マサチューセッツ州シューマッハほか ATP による分配因子 ParF の重合の構造機構。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 287、26146–26154 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schumacher, D.、Harms, A.、Bergeler, S.、Frey, E. & Søgaard-Andersen, L. パラ/マインドアトパーゼ活性化タンパク質である Pomx は、Myxococcus xanthus の細胞分裂の三重制御因子です。ライフ 10、e66160 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, K.-T.、Wu, W.、Lovell, S. & Lutkenhaus, J. MinE による MinD ATPase の非対称活性化のメカニズム。モル。微生物。 85、271–281 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パーク、K.-T. 他。 min オシレーターは、MinD に依存した MinE の構造変化を利用して、細胞質分裂を空間的に調節します。セル 146、396–407 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leipe, DD、Wolf, YI、Koonin, EV & Aravind, L. P ループ GTPase および関連 ATPase の分類と進化。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 317、41–72 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nußbaum, P. et al. 振動する MinD タンパク質は、古細菌の運動機構の細胞内での位置を決定します。カー。バイオル。 30、4956–4972.e4 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Norman, A.、Hansen, LH & Srensen, SJ 接合プラスミド: 共通遺伝子プールの容器。フィロス。トランス。 R. Soc. Bバイオル。科学。 364、2275–2289 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Schwille, P. & Diez, S. 最小システムの合成生物学。クリティカル。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．モル。バイオル。 44、223–242 (2009)。

シンデリン、J.ら。フィジー: 生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォーム。ナット。メソッド 9、676–682 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ducret, A.、Quardokus, EM & Brun, YV MicrobeJ、ハイスループット細菌細胞検出および定量分析用ツール。ナット。微生物。 1、1–7 (2016)。

記事 Google Scholar

ミルディタ、M.ら。 ColabFold - タンパク質の折り畳みを誰でも利用できるようにします。ナット。方法 19、679–682 (2022)。

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Raveh, B.、London, N.、Zimmerman, L. & Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDockab-initio: ペプチドの受容体上での同時フォールディング、ドッキング、精製。 PLoS One 6、e18934 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li、SC & Ng、YK Calibur: 多数のタンパク質デコイをクラスター化するためのツール。 BMCバイオインフォマ。 11、25 (2010)。

記事 Google Scholar

バーロウ、KA et al. Flex ddG: 変異時のタンパク質間結合親和性の変化をロゼッタアンサンブルに基づいて推定します。Ｊ．Ｐｈｙｓ．化学。 B 122、5389–5399 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pulianmacal, LT et al. 複数の ParA/MinD ATPase が、細菌細胞内の異なるカーゴの位置を調整します。 GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.7941697 (2023)。

Pulianmacal, LT et al. 複数の ParA/MinD ATPase が、細菌細胞内の異なるカーゴの位置を調整します。 GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.7941403 (2023)。

リファレンスをダウンロードする

思慮深い議論をしてくださった Joshua S. MacCready、Christopher A. Azaldegui、Joseph L. Basala、Ajai J. Pulianmaccal、Claudia Mak に感謝します。技術的な支援をしていただいた Holly Turula 氏と Miles Mckenna 氏に感謝します。この研究は、国立科学財団賞第 1817478 号 (AGV)、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム DGE 1841052 (LTP)、および MCDB 部門 (AGV) によって提供された研究開始資金によって支援されました。

ミシガン大学微生物学および免疫学部、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

リサ・T・プリアンマッカル

ミシガン大学計算医学および生物情報学部、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

ホセ・ミゲル・I・リムカオコ＆マシュー・J・オメーラ

ミシガン大学分子細胞発生生物学部、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

キールティッカ・ラヴィ、シンユー・ヤン、ジェフリー・チャン、ミミ・K・トラン、マリア・ガルミ、アンソニー・G・ヴェッキアレリ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

概念化、LTP、AGV。方法論、LTP、MJL、KR; 形式分析、LTPMJL、KR、SY、MG、MJO、AGV。調査、LTP、JZ、および MKT。リソース、AGV; 執筆 - オリジナルドラフト、LTP、および AGV。可視化、LTP、JMIL、KR、AGV。監督、LTP、MJO、AGV。資金調達、LTP、AGV

アンソニー・G・ヴェッキアレリへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Kai Thormann と他の匿名の査読者に感謝します。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Pulianmackal、LT、Limcaoco、JMI、Ravi、K. 他複数の ParA/MinD ATPase が、細菌細胞内の異なるカーゴの位置を調整します。 Nat Commun 14、3255 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

引用をダウンロード

受信日: 2023 年 1 月 12 日

受理日: 2023 年 5 月 22 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

ブログ

複数の ParA/MinD ATPase が細菌細胞内の異なるカーゴの位置を調整します